增强型无内毒素质粒大量提取试剂盒V2(100～200mL菌液)

产品货号：

SN0020

中文名称：

增强型无内毒素质粒大量提取试剂盒V2(100～200mL菌液)

英文名称：

ColPure Endotoxin-Free Maxi Plasmid Kit Plus V2

产品规格：

10T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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简要说明：

本试剂盒采用改良的碱裂解处理方法及硅胶膜吸附技术，可特异、高效地获得无内毒素高纯度质粒DNA；同时采用去内毒素溶液Endotoxin Removal Buffer及过滤器ES，可有效的去除内毒素、蛋白等杂质。所得质粒可直接用于细胞转染、酶切、连接、转化、PCR、测序等分子生物学实验。高拷贝质粒，100mL菌液通常可获得500～1500μg质粒，低拷贝质粒，200mL菌液通常可获得200～600μg质粒。

产品特点：

高纯度：采用独特的内毒素去除技术，特异的去除内毒素。
高效转染：适合包括内毒素敏感细胞在内的绝大多数细胞的转染。
应用广泛：动植物细胞转染、分子生物学实验均可应用。

适用范围：
本试剂盒适用于从100mL～200mL细菌培养物中提取多至1500μg的高纯度无内毒素的质粒DNA。

产品组成：

组分	规格
RNase A(10mg/mL)	1.1mL
Buffer BL	30mL
Buffer P1	110mL
Buffer P2	110mL
Buffer P5	110mL
内毒素清除液ERB	32mL
Buffer PW1	50mL
洗脱缓冲液EB	25mL
过滤器ES	10个
吸附柱EC2	10个
收集管	20个

保存：室温，有效期1年。

保存事项：

RNase A溶液可常温运输，收到后将其置于-20℃可保存2年。
加入RNase A后的Buffer P1置于2～8℃可保存6个月。

用户自备：
无水乙醇、异丙醇、50mL离心管。

注意事项：

细菌培养时间一般为12～16h，如接种量大则应减少培养时间，过度培养会降低质粒质量甚至导致突变。
每次使用时需观察Buffer P2和Buffer P5是否形成沉淀，如有沉淀于37℃溶解后使用。
用平衡液处理过的柱子建议立即使用，放置时间过长影响使用效果。
第一次使用前，按照瓶上标签向Buffer PW1中加入200mL无水乙醇。
Buffer P1加入RNase A后置于2～8℃保存。
各溶液使用后请立即盖紧盖子。
所有操作均在室温下进行。
质粒提取得率和质量与宿主菌的种类、质粒拷贝数、质粒的稳定性等因素有关。

使用方法：

柱平衡：向吸附柱EC2中（吸附柱放入收集管中）加入2.5mL的平衡液Buffer BL（用平衡液处理过的柱子最好立即使用），10000rpm离心2min，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中。
取100～200mL（对于高拷贝质粒，建议100mL菌液；对于低拷贝质粒，建议200mL菌液，最高不超过300mL菌液）过夜培养的菌液，10000rpm离心2min，弃上清。
尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请使用干净的吸水纸吸去管壁的水滴。
加入10mL Buffer P1（使用前将试剂盒提供的RNase A全部加入），旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀。
确保菌体沉淀悬浮均匀，含未悬浮菌块会影响裂解，导致提取质粒的浓度及纯度降低。
加入10mL Buffer P2，温和颠倒混匀6～8次，使菌体完全裂解，室温放置5min。
不可剧烈震荡，以免造成基因组DNA的污染；如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加Buffer P2的用量，在后续的操作中按比例增加Buffer P5的用量。
加入10mL Buffer P5，立即温和颠倒混匀6～8次，至溶液出现白色絮状物。然后室温放置10min左右。10000rpm离心10min，使白色沉淀离至管底（可适当增加离心时间），将全部溶液小心倒入过滤器ES中（请避免倒入大量沉淀而阻塞过滤器），慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50mL离心管中（自备）。
- Buffer P5加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
- 如离心后倒入过滤器ES中的溶液有白色沉淀也不会影响过滤。
- 如果菌体过多（＞100mL)，推荐延长离心时间至20～30min。
加入3mL内毒素清除液ERB，颠倒混匀。
加入0.3倍滤液体积的异丙醇，颠倒混匀（加入异丙醇过多容易导致RNA污染）。
将步骤7所得混合溶液转移到平衡好的吸附柱EC2中(吸附柱放入收集管中)，10000rpm离心1min，弃收集管中的滤液（吸附柱最大容积为15mL，即上步中所得溶液需分2～3次过柱）。
如果离心机转子倾角较大时，建议加入吸附柱的溶液体积不超10mL，以防漏液。
加入10mL Buffer PW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），10000rpm离心1min，弃滤液。
重复步骤9。
将吸附柱EC2放回空收集管中，10000rpm离心5min。
将吸附柱EC2置于新的50mL离心管中，开盖放置数分钟，彻底挥发乙醇。
在吸附膜的中间部位加入1～2mL洗脱缓冲液EB（60～65℃预热效果更好），常温放置2min，10000rpm离心2min，即得质粒DNA（如需较多量DNA，可将得到的溶液重新转入吸附柱，重复此步骤）。

常见问题：

质粒DNA产量低？
- 质粒拷贝数低、质粒>10kb或革兰氏阳性菌质粒。应加大菌体使用量，可使用300～500mL过夜培养物，同时按比例增加溶液P1、P2、P5的用量，洗脱缓冲液EB 60℃水浴预热，吸附和洗脱时间可以适当延长，以增加提取效率。
- 菌种问题。菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前建议先划线活化，以稳定产量。
- 细菌未充分裂解。细菌须在Buffer P1/RNase A中充分重悬或菌体不宜过多，避免成团或过量的细菌无法裂解降低产量。
质粒DNA中有基因组DNA污染？
- 菌液培养时间太长。菌液培养时间需控制在12～16h。
- 裂解问题。加入Buffer P2时，必须轻柔颠倒混匀。

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